Historia del negacionismo (IV): el test de ELISA de Roberto Giraldo

Placa multipocillos empleadas en la técnica de ELISA

Hace unos años, el señor Roberto Giraldo escribió unos resultados experimentales, que han tenido mucho éxito de difusión en Internet, escritos en formato similar a una publicación científica. La principal conclusión que expone en él es que el sistema de detección de anticuerpos contra el VIH por ELISA no da ninguna confianza, ya que si el experimento se hace en las condiciones que se utiliza para detectar otros patógenos todo el mundo sería seropositivo. Interesante resultado pero, ¿están fundamentadas esas conclusiones?, ¿se puede llegar a ellas en función de los resultados obtenidos? La mejor forma de comprobarlo es ir paso a paso, desde el autor hasta el resultado.

¿Quién es Roberto Giraldo?

No pretendo con esto hacer ni mucho menos un argumento ad hominem, simplemente pretendo presentar a la persona que ha realizado el ensayo comentado, y lo creo necesario porque seguro que muchas personas no han oído hablar con anterioridad de él. Pero al igual que existen dos (o más) versiones alrededor del SIDA, también circulan diversas versiones acerca de quién el señor Giraldo. Así en la web “free-news.org” se puede leer

Roberto Giraldo es médico y trabaja en el Laboratorio de Biología Molecular e Inmunología del Medical Cornell Hospital de Nueva York. Tras más de 25 años dedicados al estudio de las inmunodeficiencias, es uno de los científicos que han desmentido la existencia del VIH y señala los factores ambientales y del tipo de vida como los factores responsables del estrés celular que causan el SIDA. Actualmente trabaja también junto con la Administración americana en el diseño de experimentos que han de resolver la polémica sobre la existencia del supuesto VIH.

Impresionante, ¿verdad? Uno espera de alguien así un registro de publicaciones de primer nivel, pero al acudir a PubMed salta la sorpresa. Sólo hay 2 publicaciones firmadas por un tal R.Giraldo (ojo con confundir con Rafael Giraldo del Consejo Superior de Investigaciones Científicas que sí tiene unas cuantas decenas de publicaciones). Estas dos publicaciones son de 1976 en las revistas “Mycopathologica” y “American Journal of Medicine” y tratan sobre paracoccidioidomicosis, una enfermedad fúngica que afecta a campesinos de Latinoamérica. ¿25 años dedicados a las inmunodeficiencias?¿desmentido la existencia del VIH? Bueno quizás lo que ocurre es que trabaja en temas que chocan con conflictos de intereses de las farmacéuticas y por eso no publica más. Vamos que está fuera del sistema. Pero estar fuera del sistema y “trabajar junto con la administración norteamericana suena poco creíble”.

Otra versión muy diferente es la que ofrece John P. Moore, profesor de microbiología e inmunología del Weill Medical College de la Universidad de Cornell, la misma donde presuntamente el señor Giraldo ejercía. Esta versión se puede encontrar en la página web de AIDSTruth.org, y en ella se informa que:

Roberto Giraldo es un empleado del laboratorio de diagnóstico del Hospital Presbiteriano de Nueva York. Él no posee licencia para ejercer como médico en New York. Él no posee un contrato de médico. Él esta contratado en el hospital como técnico, no como médico ni como profesional docente. Giraldo no está contratado en el Weill Medical College de la Universidad de Cornell, una institución afiliada, pero separada del hospital.

Esto es sólo para conocer de la persona que hablamos, y no pretendo que se tome como un ataque personal, lo importante no es argumento de autoridad, sino de las evidencias, y esas las veremos pronto. Pero en esta serie he presentado a Peter Duesberg o a Eleni Papadopulos, con lo que el Sr. Giraldo no debe ser una excepción.

¿Qué es un ELISA?

Antes de analizar el texto de la comunicación del Sr. Giraldo, me gustaría presentaros la técnica de ELISA. Aquellos que conocéis la técnica y tenéis callo en la mano de llenar pocillos con la pipeta multicanal podéis pasar al siguiente párrafo. Un ELISA (acrónimo de “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay” es una técnica que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune de los animales, que poseen afinidad por otras moléculas (antígenos), y con la capacidad de unirse a ellas de forma estable. La técnica ELISA pretende detectar esas interacciones, depositando en una matriz sólida un antígeno, permitiendo que se una a la matriz, posteriormente añadir una solución donde se encuentra el anticuerpo contra ese antígeno, para finalizar con la adición de un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) que se une al primer anticuerpo, si éste está presente. El anticuerpo secundario suele llevar acoplado un enzima capaz de generar una reacción colorimétrica cuando se añade el sustrato del enzima. De esta forma se puede medir la señal con un espectrofotómetro, siendo la señal proporcional a la cantidad de anticuerpo II, valor que a su vez podemos correlacionar con la cantidad de antígeno depositado cuando se compara con las correspondientes curvas de calibración.

En el caso de un ELISA de detección del VIH, en la actualidad se emplean como antígenos 3 proteínas del virus, las proteínas de la envuelta gp41 y gp36, y la proteína de la cápside p24. Éstas se depositan en fondo de cada uno de los pocillos que forman la placa de ELISA (como la de la figura). Las placas están hechas de un material plástico con afinidad para las proteínas, que quedan adsorbidas en ella. Pero no cubren la totalidad, quedan huecos que no pueden quedar expuestos, ya que de ser así podría unir otras proteínas de forma inespecífica. Para evitarlo se añade una proteína ajena a lo que se quiere analizar. Tradicionalmente se usa la albúmina bovina sérica (BSA), que se ha demostrado durante muchos años que puede tapizar, sin interferir placas de ELISA, matrices de Western-blotting, etc. Tras añadir ambas proteínas se hacen lavados para eliminar el exceso de proteína, y evitar que ésta interfiera con los pasos siguientes. Cuando los pocillos están saturados de antígeno, se procede a añadir la solución de anticuerpos (o por ejemplo un suero donde se sospeche que está presente el anticuerpo). Si no se ha estandarizado la técnica se realiza un barrido de concentraciones del suero a añadir (el número de pocillos de las placas permite analizar bastantes diluciones a la vez). Si ya están establecidas las condiciones óptimas se procede a diluir el suero y añadirlo a cada pocillo e incubar un tiempo determinado a 37ºC, o la temperatura óptima de unión. Se suelen hacer duplicados del suero problema y se puede usar un suero control (sin los anticuerpos). Pasado ese tiempo de nuevo se realizan los lavados pertinentes.

Ya tenemos el antígeno, y sobre él unido los anticuerpos. El siguiente paso es emplear un anticuerpo que se une al anticuerpo unido al antígeno (anti-Ig). Este anticuerpo secundario se ha producido en animales tales como conejo o ratón, y se venden comercialmente a altas concentraciones, con lo que se ha de realizar una dilución muy alta antes de ser usados. El anticuerpo II además, lleva conjugado un enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, que produce una reacción cromogénica ante determinados sustratos. La reacción anticuerpos I y II también se incuba a 37ºC un tiempo tras el cual se lava para eliminar todo lo que no ha reaccionado y se pasa a revelar añadiendo el sustrato de la reacción. Tras parar la reacción con algún agente que inhiba al enzima se lleva la placa a un lector de placas de ELISA, que no es más que un espectrofotómetro adaptado para leer dichas placas a la longitud de onda que absorbe el sustrato de la reacción enzimática. Los valores de absorbancia se anotan para cada uno de los pacillos, junto a los cuales se apunta la dilución de suero añadida.

Este es a grandes rasgos, y saltándome muchos detalles, el protocolo de una reacción de ELISA. Uno de los pasos clave es la dilución del suero, si hay exceso de anticuerpos, estos se unirán por todas partes, de forma inespecífica y darán tanta señal que no permitirá sacar ninguna conclusión. Además, los fabricantes compiten por conseguir el sistema más sencillo y barato. Sencillo en cuanto a que se requieran el menor número posible de diluciones. El resultado de una única dilución nunca es comparable con el que se podría obtener con el barrido de varias concentraciones a la vez, pero los laboratorios de análisis que trabajan con cientos o miles de muestras al día tratan de simplificar al máximo. En ese sentido no es lo mismo un laboratorio de investigación que uno de análisis clínico.

El argumento de la dilución del suero

Lo que aparentemente levantó las sospechas del Sr. Giraldo fue comprobar que uno de los sistemas ELISA empleados para detectar anticuerpos contra el VIH (en concreto uno de la empresa Abbott) requería diluir el suero 400 veces (dilución 1:400) antes de añadirlo a la placa. Para Giraldo:

Los tests que buscan los anticuerpos de los virus de la hepatitis A y B, los de la rubéola, sífilis, histoplasma y cryptococos, por mencionar sólo unos pocos, utilizan el suero sanguíneo directamente (sin diluir). Sin embargo, para intentar evitar reacciones positivas falsas, algunos tests serológicos usan suero sanguíneo diluido; por ejemplo este es el caso de los tests que averiguan los anticuerpos de los virus del sarampión, varicela y paperas, los cuales utilizan dilución de 1:16, para los citomegalovirus (CMV) 1:20 y para los virus de Epstein Barr (EBV) 1:10. La pregunta obvia es: ¿qué hace al VIH tan especial que para analizar el suero sanguíneo, necesite ser diluido 400 veces? ¿Y qué pasaría si no diluyesen este suero sanguíneo?

Son dos buenas preguntas; vamos a por ellas. Para contestar a la primera deberemos comprobar cómo se diluye el suero en los ELISA que buscan anticuerpos contra otros patógenos. A mí, al igual que al Sr. Giraldo, también me gusta comprobar las cosas. Y lo que me he encontrado es muy diferente de lo que comenta. No quiero dudar de la validez de su afirmación, pero en la literatura científica aparecen sistemas de detección de los patógenos que él menciona con valores muy diferentes a lo que él dice. Así para detectar anticuerpos contra el herpes se pueden realizan diluciones de 1:100 (Coleman et al., 1983), para la rubéola y el citomegalovirus de 1:800 (van Loon et al., 1981), para el virus de Epstein-Barr 1:40 (Ho et al., 1989), para sarampión de 1:100 (Weigle et al., 1984) y para el virus de la hepatitis A 1:1000 (Locarnini et al., 1979). Incluso se describe un método de ELISA para anticuerpos contra el VIH para concentraciones de suero de 1:10 (Homsy et al., 1988).

Esto nos viene a decir que cada laboratorio, cada fabricante puede establecer las condiciones experimentales óptimas para sus sistemas. Pueden variar las proteínas bloqueantes, el material de las placas, el anticuerpo conjugado (secundario) empleado, la calidad del antígeno que se usa….Por tanto lo que hay que hacer es seguir el protocolo especificado por el fabricante, ya que si se varía ya no se sabe lo que se mide. Es como si le echaras gasolina diluida 100 veces en agua al depósito de tu coche, a pesar de lo que indica el fabricante. No arrancará, y no será culpa de la gasolina ni del motor, sino de seguir un protocolo para el que no está diseñado el sistema. De hecho, el protocolo de Abbott dirá 1:400, el de Homsy et al., 1:10, pero en la actualidad ya se cuentan con sistemas de detección rápida de anticuerpos donde se establecen diluciones de 1:10 o incluso de forma directa, sin diluir, tal y como muestra este vídeo:

La segunda pregunta era ¿qué pasa si no se diluye el suero?. Bien, es fácil imaginar que si no se sigue el protocolo establecido, el resultado carezca de validez. Pero aún y así veamos cómo de profundo es el análisis. Primero el Sr. Giraldo efectúa un ELISA tomando una dilución 1:400 de suero de un grupo de 9 personas que habían solicitado la prueba (deduce de ello que eran personas con alto riesgo de SIDA), incluyendo además su propia sangre, y en todos los casos el resultado es negativo. Posteriormente repite el ensayo, pero esta vez con una dilución de suero 1:1 y esta vez el resultado es positivo. Y ya está se acabaron los experimentos. Llama la atención que no empleara un barrido de concentraciones de suero, de 1:1 a 1:400, o que al menos hubiese utilizado la dilución que él mismo afirma que se usa para otros virus (por ejemplo 1:10), con lo que nos quedamos sin saber si se ha buscado la dilución que da positivo o bien no se ha hecho el experimento por un error en el diseño experimental. Tampoco se ha realizado la misma prueba de ELISA para otros virus, ¿saldría positivo con 1:1 un sistema que está diseñado para ser usado en 1:20?, si sale positivo ¿significa que todos tenemos anticuerpos contra ese virus?

Sacando conclusiones

Poco experimento para tanta conclusión porque a pesar de no incluir ningún tipo de control negativo, de no realizar el mismo análisis para otros sistemas, y de emplear un método para el que ese ELISA está diseñado concluye:

Dado que todas las muestras de sangre no diluidas reaccionan positivamente en el test de ELISA, un test que supuestamente analiza los anticuerpos del VIH, los resultados que presenta apuntan a que todos y cada uno de los humanos tienen anticuerpos del VIH, y por consiguiente sugiere que todo el mundo ha sido expuestos a los antígenos del VIH (….)
Esto significaría que todos nosotros hemos estados expuestos al virus considerado como la causa del SIDA. Las personas que reaccionan positivamente incluso a la dilución 1:400 deben ser los que han sufrido el nivel más alto de exposición a los antígenos del VIH. El resto de la gente –los que sólo reaccionan positivo con suero sanguíneo no diluido (1:1)- son los que seguramente se han enfrentado a una menor exposición al VIH

No. Lo único que muestra esta prueba (ni me atrevo a llamarla experimento) es que con la dilución 1:1 ha saturado el sistema y posiblemente hasta un elefante (empleando como anticuerpo secundario uno que reconociera las inmunoglobulinas de elefante) daría positivo en esas condiciones. A ver como explicarlo en palabras sencillas. Cuando realiza una prueba de paternidad emplea una prueba de PCR, a una temperatura de anillamiento (para que se aparee el oligonucleótido y la cadena de ADN) muy concretas y específicas. Si bajamos la temperatura baja la especificidad y la posibilidad de que se produzcan apareamientos inespecíficos aumenta mucho. ¿Estaría alguien dispuesto a pasar una prueba de paternidad con un temperatura de anillamiento de 15 grados más baja de lo aconsejado?, ¿asumiría alguien la paternidad (con el desembolso económico que ello acarrea) de todos aquellas pruebas hechas en esas condiciones?. Es una metáfora, simplemente para intentar explicar lo que ocurre cuando se emplean condiciones que no son de uso: no se puede extraer ninguna conclusión. Especialmente cuando los controles brillan por su ausencia.

La única conclusión que se puede sacar de todo esto es que no se pueden variar las condiciones para las que ha sido diseñado un sistema de detección. Hacerlo no da resultados innovadores y rompedores, hacerlo sólo produce resultados aberrantes que no admiten interpretación. Y esta muy bien hacer experimentos, pero cuando del diseño de lo mismos se puedan extraer conclusiones, no para incrementar el caos. Porque si se han de hacer experimentos se hacen, pero hacerlos por hacerlos…

Referencias:

– Coleman, R.M. et al. (1983) ELISA for the detection of herpes simplex virus antigens in the cerebrospinal fluid of patients with encephalitis. J. Virol. Meth. 7:117-125.
– Ho, D.W. et al. (1989) Rapid diagnosis of acute Epstein-Barr virus infection by an indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for specific immunoglobulin M (IgM) antibody without rheumatoid factor and specific IgG interference. J. Clin. Microbiol. 27:952-958.
– Homsy. J. et al. (1988) Detection of human immunodeficiency virus (VIH) in serum and body fluids by sequential competition ELISA. J.Virol. Meth. 19:43-56.
– Locarnini, S.A. et al. (1979) Solid-phase Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of hepatitis A-specific immunoglobulin M. J. Clin. Microbiol. 9:459-465.
– Van Loon, A. (1981) Enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of antibody against cytomegalovirus and rubella virus in a single serum solution. J. Clin. Pathol. 34:665-669.

 

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